Molekularna genetska metoda istraživanja

Za proučavanje i prepoznavanje varijanti u strukturi DNA koristi se molekularna genetska metoda. Za svaku regiju DNA koja se ispituje, regija je kromosom, gen ili alel, metode su različite. U srcu svake molekularne genetske metode sadrži neke manipulacije RNA i DNA. Sve ove metode su iznimno složene, bez laboratorijskih uvjeta, a osoblje mora biti visoko kvalificirano. Ovaj rad se provodi u nekoliko faza.

faze

Prvo, potrebno je dobiti uzorke RNA ili DNA. Ovdje, molekularni genetički postupak može se primijeniti u bilo koji materijal: kap krvi leukocita, fibroblasta kulturu, sluznica (struganje), pa folikula, - DNK se može dobiti iz bilo kojeg uzorka. To je pogodan za korištenje bilo molekularne genetičke metode i njihove različite opcije i već dugo izolirane DNA smrznuti. Druga faza je posvećen akumulacije željenim fragmenata (pojačanje) DNA, jer pomaže osigurati lančane reakcije polimeraze (in vitro u in vitro bez uključivanja živi organizam). Kao rezultat toga, odabrani fragment DNA umnožava se s ovom reakcijom lanca, a količina DNA raste doslovce milijun puta.

Treća faza molekularnih genetskih metoda istraživanja je ograničavanje množene DNA (to je fragmentacija, kidanje ili rezanje). Ograničenje se provodi pomoću elektroforeze poliakrilamida ili agaroze. Ova molekularna genetska metoda proučavanja DNA dopušta svakom fragmentu da zauzima određeni položaj u gelu. Nakon toga, gel se tretira etidij bromidom, koji se može vezati u DNA, provodi se ultraljubičasto zračenje, nakon čega se mogu promatrati luminescentne regije. Molekularne genetske metode dijagnoze su raznovrsne i brojne, međutim, prve dvije faze su tipične za sve. Ali kako bi se identificirali fragmenti DNA, gel se može bojati s mnogim drugim postojećim metodama.

vrsta

Najizravniji i rasprostranjene metode za detekciju mikobakterija može uključivati ​​gore navedeni postupak učenja molekulska genetska DNA. Njegova se bitka sastoji u otkrivanju specifičnih fragmenata lanca DNA patogena u dijagnostičkim materijalima. Molekularne genetske metode dijagnoze još nemaju učinkovitiji način prepoznavanja takve bolesti kao tuberkuloze. Korištenje lančane reakcije polimeraze (PCR), možete biti sigurni da je originalna DNA će se povećati broj kopija u milijun puta, to jest, bit će pojačanje, a to će prikazati rezultate. Razina osjetljivosti ovdje je vrlo visoka - više od devedeset pet posto, što je glavna prednost ove metode.

Ostatak molekularnih genetskih metoda istraživanja dvostruko je učinkovitiji od duplikat kopiranja, jer u ovom slučaju urednički uzorak pokazuje specifičnu oligonukleotidnu sekvencu povećanu za sto-šest puta. Čak je i kulturna dijagnoza tuberkuloze respiratornih organa znatno niža u njegovoj osjetljivosti. Zato se moderna medicina oslanja na molekularne genetske metode za dijagnosticiranje tuberkuloze. A opisana metoda je osobito učinkovita na sastanku s patogenima visoke antigenske varijabilnosti, kako bi se utvrdilo koja je na drugi način mnogo teža - posebna hranjivim medijima i dugo vrijeme uzgoja. Biokemijske i molekularne genetske metode daju posve različite učinke.

Dijagnoza tuberkuloze

Oni konstruiraju PCR dijagnostiku tuberkuloze najčešće korištenjem tih sekvenci DNA koji su specifični za sve četiri vrste ove bolesti. Da bi se postigao ovaj cilj često koriste početnika koji otkrivaju slijed je elemenata (IS-986, IS-6110), kao što su ovi elementi karakteriziraju vrlo migratornih vrsta Mycobacterium tuberculosis i uvijek prisutan više kopija u genomu. Također, DNA se može izolirati iz čistih kultura i kliničkih (sputuma pacijenata) bilo kojim drugim prihvatljivim postupkom. Na primjer, tamo gdje se postupak Boom pufera koristi se na osnovi gvanidin tiocijanata i silicij, kao DNA nosač. Broj pacijenata koji se razlikuju slab bakteriološki povećava svake godine, pa je u kliničkoj praksi je uspostavio potpuno različite razine organizacije: molekularno-genetička metoda proučavanja DNA je igrao važnu ulogu u dijagnozi.

Međutim, moramo priznati da nije bez nedostataka. Korištenje PCR metode često donosi ogromnu količinu lažnih pozitivnih rezultata, a pogreška ovdje nije samo tehničke pogreške nego i osobitosti same metode. Između ostalog, koristeći ovu metodu dijagnoze kako bi se utvrdio stupanj održivosti mikobakterija koje su identificirane, jednostavno je nemoguće. Ali taj nedostatak nije najvažniji. Molekularne genetske metode PCR dijagnostike podrazumijevaju opasnost od kontaminacije mikobakterijskog DNA. Zahtjevi za certifikaciju iz tog razloga za PCR laboratorije su izuzetno kruti, zahtijevaju prisutnost tri izolirane sobe. PCR tehnologija je moderna i vrlo složena, njegova upotreba zahtijeva odgovarajuću opremu i visoko obučeno osoblje.

bacterioscopy

Kada su rezultati dijagnoze analize treba usporediti s drugim podacima: klinički pregled, radiografiju, premazati mikroskopije, obrezivanje, pa čak i odgovor na specifične liječenja su vrlo važni. U ovoj seriji studija, PCR je samo jedna od komponenata. Otkrivanje patogena na samom početku dijagnoze može biti najjednostavnija i brza metoda - bakteriološka.

Ovdje koristimo svjetlosni mikroskop (Tsiol-Nielsen boja) i luminescent (fluorochrome coloration). Prednost bakterioskopije je brzina kojom se dobivaju rezultati. Nedostatak toga se smatra ograničenim mogućnostima zbog niske osjetljivosti. Međutim, ova je metoda preporučena od strane WHO-a kao najučinkovitijih i osnovnih za identifikaciju bolesnika s tuberkulozom. Detekcija mikobakterija bakteriološkom metodom ima vrijednost prognoze, a kvantificiranje bakterijskog otpuštanja. Molekularne genetske metode proučavanja tuberkuloze mnogo su sigurnije u tome.

Kulturno istraživanje

Najbolja detekcija mikobakterija prepoznata je studijama kulture. Sjetva patološkog materijala provodi se u medijima jaja: Mordovsky, Finn II, Levenshtein-Jensen i slično. Mjerila otpora mikobakterija na lijekove i neizravne dokaze o učinkovitosti brojnih mikobakterija i njihovih kolonija in vitro, ako primijenjene metode istraživanja kulture. Da bi se povećao postotak dodjele mikobakterija, patološki materijal se sije na nekoliko medija.

Zadovoljavajući brojne kulturne potrebe, uzročnik je također osiguran tekućim medijima. Istodobno se rabe automatizirani sustavi računovodstva za rast VANTES tipa. Biljke treba inkubirati do sedam do osam tjedana. Do tog vremena, sjetva s nedostatkom rasta može se smatrati negativnim. Najučinkovitiji način identificiranja mikobakterija tuberkuloze je biološka ispitivanja: inficirati dijagnostički materijal zamoraca, koji su iznimno osjetljivi na tuberkulozu.

Nekoliko figura

Zanimljivo područje istraživanja, koje je otvorio PCR dijagnostika bio je proučiti M. tuberculosis - latentnu infekciju. Suvremeni koncept TB infekciju upućuje na to da od stotinu ljudi koji su bili u kontaktu s M. tuberculosis, devedeset i može biti zaraženo, ali samo deset od njih su aktivna bolest se razvija. Ostatak ima antituberkulozni imunitet, pa stoga u devedeset posto slučajeva infekcija ostaje latentna. To je bila molekularna genetska metoda koja je pomogla otkriti ovaj uzorak.

Genetičari kažu da pedeset i pet posto onih čiji usjevi patološki materijal bili negativni, a osamdeset posto ljudi zaraženih s M. tuberculosis, ali teče bez radioloških manifestacijama bolesti, PCR pozitivan odgovor dobili. To je genetski dijagnostička metoda pomoglo identifikaciji pacijenata ugrožena PCR istraživanjima s rezultatima njihovih analiza (mikroskopije i kultura) su negativne i subkliničkog infekcije M. tuberculosis bio prisutan.

Suvremena istraživanja

Bakteriološki laboratoriji Ruske Federacije koriste ubrzanu metodu apsolutnih koncentracija: aktivnost nitrat reduktaze mikobakterija testirana je pomoću Grissovog reagensa. Centri za borbu protiv tuberkuloze koriste metodu koja omogućuje određivanje otpornosti na lijekove. To je kultura u tekućim medijima, gdje je automatiziran radiometrijski i fluorescentni sustav za snimanje rasta mikobakterija. Takva analiza je učinjena brzo - do dva tjedna.

Trenutačno se razvijaju nove metode: otpornost mikobakterija na lijek procjenjuje se na razini genotipa. Istraživanje molekularnih mehanizama otpornosti pokazuje prisutnost gena u mikobakterijama. Ovi geni povezani su s otporom na određene lijekove. Na primjer, Kasa gena, inhA, katG otporan na izonijazidom, rpoB gena - rifampicinomje 16Sp RNA gena i rpsL - streptomicina, emb1 - na etambutol gyrA - što je fluorokinolona i tako dalje.

mutacije

U suvremenoj dijagnostici molekularna genetska razina DNA metode značajno je povećana i dopuštena je provođenje velikih studija mutacija u cijelom spektru. Sada znamo da su mutacije u 516, 526 i 531 kodona gena rpoB najčešća i identificirana je otpornost na različite lijekove. Postoji cijeli niz metoda za tipiziranje mikobakterija ne samo tradicionalnim metodama - biokemijskim, biološkim i kulturološkim, već su i široko korištene moderne molekularne genetske metode. Već postoje adekvatne i pouzdane dijagnostičke metode za otkrivanje monogenih bolesti. Temelji se na istraživanju DNA u točno određenom području gena. Ovo je obično složen proces, dugotrajan i skup, ali podaci dobiveni metodama molekularne genetske analize mnogo su točniji i informativniji od podataka svih ostalih analiza.

Odavno je poznato da je DNK ne mijenja tijekom cijelog života organizma da je u svakom stanica s jezgrom odnakova, a to omogućava da se analiza apsolutno sve stanice u tijelu, u bilo kojoj fazi posebnom pažnjom. Oštećeni gen može se otkriti prije pojavljivanja prvih simptoma, prije nego što se razotkrila klinika bolesti, kao i kod zdravih heterozigotnih ljudi, ali imaju mutaciju u genu. Molekularni genetički nasljedna bolest dijagnostičke metode omogućuju da se otkrije na (izravni pristup, DNA-dijagnostiku), kao i za analizu segregacije bolesti u obitelji s marker lokusa DNK (genetski polimorfizam), koji su usko povezani s oštećenjem gena (tj, indirektno pristup DNA-dijagnostike). Izravna ili neizravna - svaka dijagnoza DNA temelji se na metodama koje identificiraju strogo definirano područje ljudske DNK.

Izravne metode

Izravne metode dijagnosticiranja DNA koriste se u slučajevima kada je poznat genski genom nasljednih bolesti, a poznate su i vrste mutacija. Na primjer, izravne metode prikladne su za različite bolesti. Ovo je Huntingtonova koreja (ekspanzija CTG ponavljanja), fenilketonurija (R408W), cistična fibroza (delF508, glavna mutacija) i slično. Glavna prednost izravne metode je sto posto točnosti dijagnoze, a nema potrebe za DNA analizom ostatka obitelji. Ako se pronađe mutacija u odgovarajućem genu, to vam omogućuje da točno potvrdite dijagnozu nasljedstva, odredite genotip za ostatak opterećene obitelji.

Druga prednost izravne dijagnoze jest otkrivanje heterozigotnog prijevoza loših mutacija u rođacima i roditeljima pokojnika iz bolesti. To se posebno odnosi na bolesti autosomnih recesivnih bolesti. Nedostaci izravnih metoda također su dostupni. Da biste ih primijenili, trebate točno znati lokalizaciju patološkog gena, strukturu egzona i intona i spektar njegovih mutacija. Nisu sve monogene bolesti danas primile takve informacije. Informativnost izravnih metoda ne može se smatrati potpunim jer isti gen može imati velik broj patoloških mutacija, što određuje razvoj nasljednih bolesti.

Neizravne metode

Neizravne metode u DNK dijagnostici se koriste na sve, u drugim slučajevima, ako je oštećen gen nije identificiran, ali samo kromosomski, ili ako je dijagnoza linija nije dao rezultat (to se događa, ako je gen kompleks molekularna organizacija ili u velikoj mjeri, ako postoji puno patološke mutacije). Neizravne metode koriste se za analizu segregacije polimorfnih markera u obitelji alela. Markeri se nalaze u istom ili lokus kromosomske regije usko povezan s bolesti i predstavljaju delecije ili insercije, točka zamjene, ponavljanja, a njihova je polimorfizam zbog različite količine stanica u bloku.

Najpovoljniji za indirektnu dijagnozu su mikrosateliti i minisatelliti polimorfni markeri, koji su široko rasprostranjeni u ljudskom genomu. Njihova je vrijednost izražena u visokoj informativnosti, ako genetska udaljenost između oštećenja u genu i markera nije prevelika. U potonjem slučaju, točnost evaluacije u velikoj je mjeri određena frekvencijom rekombinacije između polimorfnog markera i lezije. Indirektne dijagnostičke metode pružaju obvezno preliminarni korak frekvencije alela za analizirane studije kod pacijenata populacije i nosača mutacija, plus nužnost određivanje vjerojatnosti rekombinacijom neravnoteže i adhezijske markera i mutanata alela.

Ostale metode

Kratki segmenti RNK ili DNA, kao i jedan gen, ne mogu se vizualizirati mikroskopskim pregledom, stoga, kako bi se identificirali mutacije, potrebne su metode molekularne genetske dijagnostike. Postojeći "Projekt ljudskog genoma", kao i ostala postignuća u molekularnoj genetici, u mnogočemu je proširila mogućnost dijagnosticiranja nasljednih bolesti - i prije i poslije nataliteta. Te metode mogu omogućiti rano otkrivanje i predviđanje poli- i monogenskih bolesti u kojima se debi pojavljuje u odrasloj dobi. Nažalost, u smislu tehničkih mogućnosti, molekularna genetska istraživanja ponekad nadilaze etičke okvire koji se uspostavljaju s obzirom na nasljedstvo, osobito kada se dijagnoza provodi u adolescenciji i djetinjstvu.

Strukturne i kvantitativne anomalije kromosoma najčešći su uzroci onkoloških bolesti i mnogih razvojnih anomalija. Potrebno je identificirati kromosomske aberacije, što je važno za obiteljsko savjetovanje - procijeniti prognozu zajedno s reproduktivnim rizikom u budućim trudnoćama. Analiza kromosoma je "zlatni standard" genetske dijagnoze, ali ima i ograničene mogućnosti. Samo metode molekularna genetska analiza mogu učiniti više, jer koriste fluorescentne oznake na temelju tehnologija kloniranja, sposobne su detektirati, sa svojim visokom osjetljivošću, suptilne kromosomske promjene koje se ne mogu otkriti klasičnim citogenetska istraživanja. Te tehnike sve više šire naše dijagnostičke sposobnosti kada se ispituju djeca s razvojnim defektima, mentalnom retardacijom i mnogim drugim nasljednim bolestima.

nalazi

Vrlo je važno za čovječanstvo znanje o strukturi i funkcijama gena, vrsta njihove varijabilnosti, sposobnost prepoznavanja nasljednih bolesti koje su se dogodile u vezi s razvojem molekularne genetike. Njegove su metode usmjerene na proučavanje DNA molekule - i kada je normalno, i ako je oštećen. Priprava nukleotidnih sekvenci deoksiribonukleinske kiseline (DNA) prolazi korak po korak od pripreme uzoraka do prepoznavanja pojedinih fragmenata. Izolacija genomske DNA iz stanica, ograničenje (trganja), pojačanje (kloniranje), elektroforeza fragmenata (odvajanje njihove električni naboj i molekulsku masu na agaroznom gelu). Identifikacija određenih fragmenata koji se nalaze na svojoj površini diskretnom trakom.

Zatim uzimajući u act posebne filtera, kroz koje prolazi svaki fragment hibridizacija klonirane DNA fragmenata ili sintetičke radioaktivnih sondi je kontrola, koji će biti jednak svakom ispitnom uzorku. Ako promijenite položaj ili dužinu usporedbi sa sondom, ako je novi ulomak ili nestalo - sve to ukazuje da analiziraju gen je kroz restrukturiranje u sekvenci nukleotida. Ima osam osnovne tehnike molekularno genetičke studije: sekvenciranja (Određivanje DNA sekvence), lančane reakcije polimeraze (povećanje broja sekvenci), priprema početnice poznatih gena, DNK kloniranje, proizvodnja rekombinantnih molekula izvedena proteina zbog rekombinantne molekule, stvarajući komplet (zbirka biblioteka) kloniranih fragmenata koji su dobiveni restrikcijom.